RT-qPCR引物/探針（套裝）

SARS-CoV-2 Confirm

一、產(chǎn)品用途：
RT-PCR引物/探針（英文名：SARS-CoV-2 Confirm），用于定性檢測和分析病毒RNA。它僅用于研究，不用于臨床診斷。

二、產(chǎn)品描述：
1. 該產(chǎn)品包括三個小管：
①橙蓋：（凍干粉），1管。
此管為病毒引物/探針，可特異性擴增的RdRp基因（即RNA依賴性RNA聚合酶基因），而其他冠狀病毒RNA不會被檢測到【1】【2】。（該引物/探針依據(jù)WHO診斷參考實驗室公布的引物/探針序列而設計【1】。
如要檢測其他冠狀病毒，推薦MB公司提供的其他冠狀病毒引物/探針，品名：CoV Screen (without ConviFlex™ RT-Taq Mix)，貨號：271-1100。
②綠蓋： Positive Control RNA（陽性對照RNA，凍干粉），1管。
此陽性對照RNA為一段合成的RNA序列（序列來自武漢的病毒株）。
③白蓋： PCR Grade Water（液體），1管。
2.使用前，①橙蓋和②綠蓋先用PCR級水（③白蓋）復溶，并分裝，避免反復凍融。
3.該引物/探針應與MB公司提供的【RNA病毒檢測試劑盒】（英文名：ConviFlex™RT-Taq Mix,
貨號192-0025/-0100/-0250）一起使用，用于RT-qPCR反應檢測。
4．檢測樣本需為抽提過的RNA樣本。
5.靶基因RdRp是用FAM™通道檢測，擴增的人RNA酶P基因（過程對照）用ROX™通道檢測，用以評估樣本的制備質量。

三、產(chǎn)品特點：
1. 靶點特別。依據(jù)WHO國際標準，此引物探針為RdRp基因，而非市面上常見的ORF1ab和N基因或E基因。
2.陽性對照RNA為一段合成的RNA序列（序列來自武漢的病毒株）。
3. 主要組分為凍干粉，4℃保存，儲存運輸方便，性能穩(wěn)定。
4. 適用于科研中，各種來源的RNA樣本，包括拭子、活檢組織、哺乳動物細胞和細菌等。

四、需用戶自己準備的試劑耗材和儀器：
1.RNA病毒檢測試劑盒（RT-qPCR法）
（英文名：ConviFlex™ RT-Taq Mix，貨號192-0025/-0100/-0250）
2.熒光定量PCR儀（qPCR儀）
3.無DNase和RNase的qPCR反應管
4.離心機
5.移液器及帶濾芯吸頭（不含DNase和RNase）
6.用戶自己提取的RNA或現(xiàn)成的RNA樣品。（抽提過程建議使用商品化的RNA提取試劑盒完成，如MB廠家的：
【病毒RNA提取試劑盒】（ExtractNow™ Virus RNA Kit，貨號611-1010/-1050/-1250）
或【病毒RNA拭子提取試劑盒】（ExtractNow™ Virus RNA Swab Kit，貨號611-2250）。

五、操作注意事項：
該引物/探針應僅由經(jīng)過培訓的實驗室人員使用。
始終穿上合適的防護服和戴一次性手套。
根據(jù)樣品類型，應謹慎處理所有樣品。請遵循WHO推薦的方法處理樣本。
該試劑盒不含有害物質。 殘余物可以根據(jù)當?shù)胤ㄒ?guī)丟棄。

六、操作步驟：
步驟1. 試劑制備
①橙蓋 Mix引物探針凍干粉，最大速離心5秒鐘，加入525lPCR級水（白蓋），室溫靜置5分鐘后，渦旋并離心5秒鐘，分裝，待用或-18℃保存。
②綠蓋Positive Control RNA陽性對照凍干粉，最大速離心5秒鐘，加入105lPCR級水（白蓋），室溫靜置5分鐘后，渦旋并離心5秒鐘，分裝，待用或-18℃保存。


步驟2. RT-qPCR引物/探針mix制備（20μl反應體積）
（1）1個反應需要加入：酶預混液 （自備的紅蓋預混液）10l ，
橙蓋（復溶的Mix引物/探針）5l
（紅蓋預混液 來自MB公司的【RNA病毒檢測試劑盒】（RT-qPCR法），
英文名：ConviFlexRT-Taq Mix, 貨號192-0025/-0100/-0250，需單獨購買）


（2）將以上引物/探針mix渦旋混勻，并離心5秒鐘。

（3）每個PCR管中加入15μl上述引物/探針mix和5μl樣本（抽提后的RNA），
或5μl RNA提取試劑盒中的洗脫緩沖液，作為陰性對照，或5μl PCR級水作為無模板對照，或5μl陽性對照RNA。

（4）緊扣PCR管，然后短暫離心。

（5）將PCR管放置qPCR儀上，緊上頂蓋。


步驟3. 設置qPCR程序
1個循環(huán)： 55 ℃，10分鐘
1個循環(huán)： 94 ℃，3 分鐘
45個循環(huán)：94 ℃，15秒
58℃，30秒  

步驟4. 啟動程序

步驟5. 數(shù)據(jù)解讀

七、使用注意事項：
1.使用前應認真閱讀說明書。
2.來自不同批次的試劑不能混合。
3.試劑盒內的試劑應始終作為一個整體溶解分裝。
4.試劑盒應在效期內使用。
5.每次PCR至少應設置一個陽性對照。每次PCR至少應設置一個陰性對照和/或一個無模板對照。如果實驗者自己抽提RNA，則可使用洗脫緩沖液作為陰性對照。對照必須與待測樣品的處理方式相同。您也可能需要其他實驗室提供的對照品，例如含高、中、低不同濃度的RNA樣品。使用對照，對于確認結果的可靠性或用于排除故障非常有意義。
6.建議在無RNA和DNA污染的條件下進行RT-PCR，以避免操作過程中DNA或非特異RNA的交叉污染。（MB公司推薦使用PCR污染祛除噴霧，英文名：PCR Clean™，貨號15-2025，預先清潔實驗環(huán)境。）
7.盡量減少RNA樣品的凍融次數(shù)，同時避免RNA酶污染，以減少RNA降解的風險。（RNA降解會極大地限制了RT-qPCR反應的性能）。請確保高質量的完整RNA用于檢測。
8.樣本制備過程中，注意避免其他DNA的污染，DNA的干擾也會降低qPCR的準確性。


八、參考文獻
1. Corman VM, Bleicker T, Brünink S, Schneider J, Drosten C. Diagnostic detection of  by real-time RT-PCR.


2. Corman VM, Landt O, Kaiser M, Molenkamp R, Meijer A, Chu DKW, Bleicker T, Brünink S, Schneider J, Schmidt ML, Mulders DGJC, Haagmans BL, van der Veer B, van den Brink S, Wijsman L, Goderski G, Romette JL, Ellis J, Zambon M, Peiris M, Goossens H, Reusken C, Koopmans MPG, Drosten C. Detection of 2019 novel coronavirus by real-time RT-PCR. Euro Surveill. 2020 25(3). doi: 10.2807/1560-7917.ES.2020.25.3.2000045.


九、精確檢測，還會用到：