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CCA顯色培養(yǎng)基在水的標(biāo)準(zhǔn)檢驗中的應(yīng)用

更新時間:2018-09-14  |  點擊率:1870

微生物檢測產(chǎn)品生產(chǎn)商HiMedia Laborotaries公司生產(chǎn)的CCA顯色培養(yǎng)基(貨號:M1991I-500G,英文品名:HiCromeTM Chromogenic Coliform Agar)是一款值得注意的產(chǎn)品,因為它的成分和性能符合新版的ISO9308-1標(biāo)準(zhǔn)(2014版),而該標(biāo)準(zhǔn)論述的正是有關(guān)大腸桿菌和大腸菌群計數(shù)的水質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)檢驗。

 

ISO9308-1.2014采用的是濾膜法聯(lián)合CCA顯色培養(yǎng)基法,用于水中大腸桿菌和大腸菌群的計數(shù)。它出結(jié)果的時間更短,只有24小時(而2000年版ISO9308采用乳糖TTC瓊脂,需48小時),而且無須額外的培養(yǎng)基進行驗證試驗。

 

在CCA顯色培養(yǎng)基中,大腸菌群(不含大腸桿菌)表達β-D-半乳糖苷酶,分解顯色底物,從而為粉紅色菌落;大腸桿菌同時表達β-D-半乳糖苷酶和β-D-葡萄糖醛酸酶,表現(xiàn)為藍紫色菌落;而其他非大腸菌群菌(如綠膿桿菌、沙門氏菌)為無色;糞腸球菌的生長則受到抑制。

 

 

圖. HiCromeTM CCA顯色培養(yǎng)基培養(yǎng)反應(yīng)

 

為什么要同時檢測大腸菌群和大腸桿菌?對于人類來說,水被糞便污染一直是一個問題。大腸桿菌,其實是人腸道的正常菌群,它隨糞便被排出體外,因而被看作是水是否被糞便污染的指示菌。大腸菌群則較為復(fù)雜,因為有的大腸菌群生活在土壤和新鮮的地表水中,并不總是在人的腸道內(nèi)。大腸菌群并不作為糞便污染的指征,但可以指示出水在凈化、儲存和運輸過程中存在的問題。

 

ISO9308-1.2014中的操作方法大致如下:先取水樣100ml(或其他體積),在5±3℃運輸和保存。應(yīng)保證在取樣的24小時內(nèi)檢測。再將水樣用濾膜過濾。過濾膜應(yīng)47mm或50mm直徑,0.45μm孔徑,有網(wǎng)格線,并且需保證無菌。過濾后細菌就被截留在濾膜上,然后將濾膜貼到CCA顯色培養(yǎng)基上。放置時應(yīng)保證下面沒有氣泡。然后倒轉(zhuǎn)平板,孵育21±3小時,36±2℃。之后就可檢查過濾膜上的菌落并計數(shù)。

 

ISO9308-1.2014指出,顯色后,大腸菌群(粉紅色菌落)應(yīng)再用氧化酶試紙條進行驗證試驗(大腸菌群為氧化酶陰性),因為一些氧化酶陽性菌(如氣單胞菌屬)可能帶來假陽性。具體是應(yīng)至少選擇10個粉紅菌落,進行氧化酶試驗,或向平皿中的濾膜滴加氧化酶試劑2-3滴,陽性反應(yīng)為深藍色(30秒內(nèi))。大腸桿菌無須驗證。如需驗證時,可進行吲哚試驗。大腸桿菌為吲哚試驗陽性,而其他大腸菌群為陰性。

 

值得指出的是,該標(biāo)準(zhǔn)方法選擇性不強,它適合低菌群背景的樣本,因為背景生長可能干擾計數(shù)。ISO指出,它適合菌落數(shù)小于100的水樣,例如:飲用水、自來水、消毒的池水,而對于地表水和井水,該方法并不適合。

 

注意:對于大腸桿菌O157,CCA培養(yǎng)基不會將其識別為大腸桿菌。大腸桿菌O157將被識別為大腸菌群。對于總大腸菌群計數(shù),它應(yīng)等于氧化酶陰性的粉紅色菌落數(shù)+藍紫色菌落數(shù)。

 

據(jù)ISO資料顯示:CCA培養(yǎng)基的靈敏度為94%(大腸桿菌)和91%(大腸菌群),特異性為97%(大腸桿菌)和94%(大腸菌群),可見性能還是相當(dāng)不錯的。而HiMedia公司更提供有化學(xué)限定的CCA顯色培養(yǎng)基,這保證培養(yǎng)基的批間差異極小,批次結(jié)果穩(wěn)定,重復(fù)性和準(zhǔn)確度進一步提升。

 

我國《GB8538—2016食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)·飲用天然礦泉水檢驗方法》提到濾膜法計數(shù)大腸菌群。具體是將過濾水樣的濾膜貼在選擇性鑒別培養(yǎng)基上,經(jīng) 37℃ 培養(yǎng)24h后,大腸菌群細菌在濾膜上長出具有特征性的菌落,直接計數(shù)典型菌落數(shù),計算出每 100mL 水樣中所含的大腸菌群數(shù)。所用培養(yǎng)基為遠藤瓊脂(品紅亞硫酸鈉)培養(yǎng)基。長出的菌落還需進行革蘭氏染色鏡檢觀察。如為革蘭氏陰性無芽孢桿菌,再接種乳糖蛋白胨培養(yǎng)液,經(jīng)36℃±1℃培養(yǎng) 24h±2h 后,如產(chǎn)酸產(chǎn)氣則判定為大腸菌群陽性。整體耗時較長,步驟較多。

 

《GBT5750.12-2006 生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗方法——微生物指標(biāo)》檢測指標(biāo)包括總大腸菌群和大腸埃希氏菌,都提到酶底物法??偞竽c菌群也是根據(jù)用選擇性培養(yǎng)基上篩查β-半乳糖苷酶陽性菌,并提到“可選用市售商品化制品,以此計數(shù)來檢測水中總大腸菌群”。大腸埃希氏菌是根據(jù)β-葡萄糖醛酸酶。檢測方法是兩類菌分開論述的。而CCA顯色培養(yǎng)基可同時計數(shù)并鑒別這兩類菌,不可不謂具有更高的效率。

 

據(jù)悉,上海市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局已通知,將要更新發(fā)布《DB31/T 1091-2018 生活飲用水水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)》,2018年10月1日開始實施。這雖然是地方性的條例,但畢竟對2006年的國標(biāo)進行了一些改進,估計可能會采納ISO9308-1.2014的方法。

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